一、校准总体要求

1.校准顺序（必须严格遵守，更换卤素灯后必须全套按此顺序执行）

ROI校准→背景校准(Background)→光学校准(Optical)→纯染料光谱校准(PureDye)→RNaseP性能验证→温度校准

2.校准周期（Thermo原厂规定）

3.前置条件

1.环境：温度15～30℃，湿度45%～75%，无阳光直射、无振动；仪器开机预热30min，卤素灯充分稳定。

2.软件：7500Softwarev2.3版本；路径：Instrument→InstrumentMaintenanceManager（仪器维护管理器）。

3.耗材：原厂校准板（ROI板、背景板、染料校准板），-20℃避光保存，开封最多重复使用3次，有效期12个月；上机前瞬时离心，液体全部甩至孔底，无气泡。

4.硬件：卤素灯使用时长＜2000h，灯老化会直接导致ROI校准失败。

二、分项详细校准步骤

（一）ROI感兴趣区域校准（孔位定位校准）

作用：CCD相机精准识别96个反应孔位置，消除孔间读取偏移。

1.更换仪器托盘专用校准托板；放入ROI校准板，A12缺口对准托盘右上角，卡紧密封。

2.软件打开【MaintenanceManager】→【ROI】选项卡。

3.选择【StartCalibration】自动校准；向导依次点击Next，最后点击【StartRun】，运行约10min。

4.结果判定：显示Passed为合格；若失败，改用【StartManualCalibration】手动模式，适当延长曝光时间；检查校准板有无挥发、气泡。

5.保存校准文件，自动写入仪器配置。

（二）Background背景荧光校准

作用：扣除仪器、空板、缓冲液本底荧光，消除杂散光与孔间基线差异。

1.取出ROI板，更换原厂空白背景板（或用无酶水自制空白板，全孔加满纯水），离心除气泡。

2.在维护管理器切换至【Background】，启动校准程序。

3.程序自动采集各通道空白荧光基线，运行完成提示Pass。

每月必做；出现非特异基线升高、孔间本底差异大时，可临时加测背景校准。

（三）Optical光学校准（仅ABI7500标准版，7500Fast无此项）

作用：补偿4个滤光片通道之间的光学响应差异，校正通道间荧光偏差。

1.保持仪器稳定，无强光干扰，放入光学校准板。

2.打开【OpticalCalibration】，跟随向导运行，自动完成多通道响应均衡。

3.校准合格后，4个荧光通道（FAM、VIC、NED、ROX）响应趋于一致。

（四）PureDye纯染料光谱校准（染料补偿校准）

作用：采集各荧光染料的发射光谱，用于多色实验的光谱拆分，避免通道串色。

1.放入FAM、VIC、NED、ROX单染料校准板，严格对应板型。

2.进入【PureDyeCalibration】，依次采集每种染料的光谱文件。

3.保存光谱模板，后续TaqMan多重荧光实验调用此文件。

4.自定义染料：配置无淬灭荧光寡核苷酸，做自定义染料ROI与光谱校准（附录B）。

（五）RNaseP仪器性能验证（IPV验证，定量性能考核）

1.使用原厂TaqManRNaseP预填板，瞬时离心后上机。

2.调用预设的RNaseP验证程序，运行扩增。

3.合格标准：梯度拷贝数Ct重复性RSD＜2%；可稳定区分5000与10000拷贝浓度，置信度99.7%；线性R²＞0.998，无明显孔间偏差。

4.仪器搬迁、大修、更换光源后必须执行此项验证，每年至少1次。

（六）温控系统校准（计量检定项目，第三方完成）

1.温度示值误差：加热模块9点测温，实测温度与设定值偏差≤±0.25℃。

2.孔间温度均匀性：整板各孔温差≤±0.3℃。

3.升降温速率（Ramprate）：实测升降温速度与标称值偏差在允许范围内。

4.出具计量校准证书，每年送检一次。

三、更换卤素灯后的强制校准流程

1.更换卤素灯→复位灯计时（LampTimerReset）；

2.仪器硬件自检Self-test；

3.ROI校准→背景校准→光学校准→染料光谱校准；

4.最后运行RNaseP性能验证，确认定量结果正常。

四、常见故障处理

1.ROI校准全孔/部分孔失败校准板失效、液体挥发；离心重新处理；卤素灯超时老化（＞2000h），更换光源；托盘未卡紧、盖板闭合不严。

2.通道串色严重重新执行PureDye染料校准，更新光谱文件。

3.孔间Ct值差异过大重做Background背景校准+光学校准，同时核查温控均匀性。